Тема: Техника изготовления временных микропрепаратов
Материалы. Листья традесканции виргинской (Tradescantia virginica), подсолнечника (Helianthus annuus); тычинки из цветков мальвы (Malva sp.), зафиксированные в 90-96%-ном спирте; комплект постоянных микропрепаратов "Анатомия растений"; лактофенол, сернокислый анилин.
Для изучения растительных объектов с помощью светового микроскопа необходимо приготовить микропрепарат. Микропрепараты, не предназначенные для длительного хранения, называются временными. Изучаемый объект помещают на предметное стекло в каплю воды, глицерина, раствора, реактива или красителя и накрывают покровным стеклом. Такие препараты можно хранить в течение нескольких дней, поместив во влажную атмосферу.
Если объекты помещают в бальзам, глицерин с желатиной или целлоидин, препараты сохраняются годами и называются постоянными.
Некоторые растения или их органы (водоросли, споры, пыльца и др.) можно рассматривать под микроскопом целиком, без предварительного изготовления срезов. Такие препараты называются тотальными.
Однако число объектов, которые можно изучать на тотальных микропрепаратах невелико. Чаще приходится делать срезы органов, подлежащих изучению. Срезы изготавливают из свежих или фиксированных частей растений. Обычно для фиксации употребляют растворы спирта или формалина. Сделанные срезы должны быть очень тонкими и прозрачными. Различают следующие виды срезов: поперечный и продольный ( радиальный, тангентальный, парадермальный) (рис. 5, Б).
Поперечный срез проходит перпендикулярно оси органа и позволяет изучить строение органа в поперечном сечении.
Продольный радиальный срез проходит по радиусу оси органа и дает возможность изучить строение органа в продольном сечении.
Продольный тангентальный срез проходит перпендикулярно радиусу цилиндрической структуры, например, корня или стебля; в случае вторичных ксилемы и флоэмы проходит под прямым углом к сердцевинным лучам.
Парадермальный срез (греч. пара + дерма - кожа) - сечение, параллельное поверхности плоской структуры, например, листа (срез эпидермы листа).
Правила изготовления анатомических срезов
При изготовлении временных микропрепаратов необходимо соблюдать следующую последовательность операций:
• Вымыть и тщательно вытереть предметное и покровное стекла. Чтобы не сломать очень хрупкое покровное стекло, надо поместить его в складку салфетки между большим и указательным пальцами правой руки и осторожно вытереть его круговыми движениями пальцев;
• Нанести на предметное стекло пипеткой каплю жидкости (воды, глицерина, раствора, реактива или красителя);
• Сделать срез изучаемого органа при помощи лезвия. Лезвие должно быть очень острым. Для изготовления срезов, мелкие объекты поместить между кусочками из сердцевины бузины или пенопласта (рис. 5, А). Лезвием выровнить верхнюю поверхность пенопласта вместе с объектом. Затем сделать тонкий срез, ведя лезвием к себе наискось одним плавным и быстрым движением. При этом объект держать строго вертикально, а лезвие - строго горизонтально. Обе руки должны быть совершенно свободны. Не следует ими опираться на стол или прижимать к груди (рис. 6). Сделать сразу несколько срезов. Лезвие и объект все время смачивать.
• Выбрать самый тонкий срез, перенести его с помощью препаровальной иглы или тонкой кисточки в центр предметного стекла в каплю жидкости;
• Закрыть срез покровным стеклом так, чтобы под него не попал воздух. Для этого покровное стекло взять двумя пальцами за грани и подвести под углом нижнюю грань к краю капли жидкости и плавно его опустить;
• Если жидкости много, и она вытекает из-под покровного стекла, удалить ее при помощи фильтровальной бумаги. Если же под покровным стеклом остались места, заполненные воздухом, то добавить жидкость, поместив ее каплю рядом с краем покровного стекла, а с противоположной стороны фильтровальную бумагу.
Рис. 5. Закладка объекта в сердцевину бузины (А) и сечения цилиндрического органа (Б):
1 - поперечное, 2 - продольное радиальное, 3 - продольное тангентальное.
Рис. 6. Положение рук при изготовлении среза.
Ход работы
Задание 1. Приготовить 2 тотальных микропрепарата пыльцы мальвы (Malva sp.): пыльца в воздухе (без покровного стекла) и в лактофеноле. Рассмотреть оба препарата при малом увеличении, отметив особенности сред, в которые помещены пыльцевые зерна. Исследовать строение пыльцы при большом увеличении микроскопа. Сделать рисунок.
Последовательность работы. На середину предметного стекла пипеткой нанести каплю спирта с пыльцой. После высыхания спирта, препарат положить на предметный столик микроскопа и рассмотреть пыльцевые зерна в окружении воздуха. Показатели преломления стекла, воздуха и пыльцы существенно различаются. Поэтому в воздушной среде видны лишь грубые и сильно затемненные элементы структуры. Чтобы избежать не желательных оптических явлений, надо рассмотреть пыльцу в среде, показатель преломления которой близок к показателю преломления стекла. Такой средой служит лактофенол. Стеклянной палочкой на объект нанести каплю лактофенола, затем накрыть его покровным стеклом.
Готовый микропрепарат поместить на предметный столик и исследовать. При малом увеличении видны крупные шаровидные пыльцевые зерна с шиповидными выростами на поверхности (рис. 7). При большом увеличении и перемещении тубуса с помощью микрометренного винта пыльцевые зерна рассмотреть в разных плоскостях: то с поверхности, то в оптическом разрезе. На поверхности пыльцевого зерна хорошо видны выросты стенки. Ближе к периферии они кажутся удлиненными и заостренными, ближе к центру - более шаровидными, а в проекции они имеют вид небольших окружностей. Кроме выростов, на поверхности расположены ростковые поры, через которые в период прорастания пыльцы выходят пыльцевые трубки.
Слегка опустить тубус с помощью микрометренного винта и рассмотреть густое темное внутреннее содержимое (которое отстало от стенки вследствие обезвоживания его спиртом) и две стенки: внутреннюю тонкую - интину и наружную толстую с шаровидными выростами - экзину . После детального исследования при большом увеличении зарисовать одно пыльцевое зерно и обозначить экзину, шиповидные выросты, ростковую пору, интину, внутреннее содержимое.
Рис. 7. Пыльцевое зерно мальвы (Malva sp.) (часть зерна в оптическом разрезе):
1 - экзина, 2 - шиповидный вырост, 3 - ростковая пора (вид сверху), 4 - ростковая пора (вид сбоку), 5 - интина, 6 - внутреннее содержимое.
Задание 2. Приготовить временный препарат парадермального среза эпидермы с нижней стороны листа традесканции виргинской (Tradescantia virginica) в капле воды, и рассмотреть его под микроскопом.
Последовательность работы. Для изготовления препарата лист традесканции обвернуть вокруг указательного пальца левой руки так, чтобы нижняя сторона фиолетового цвета была обращена наружу. Правой рукой при помощи препаровальной иглы надорвать эпидерму над средней жилкой в средней части листа и пинцетом снять ее кусочек. При этом невольно захватывается и часть мякоти листа (мезофилла), но обычно можно найти тонкий участок на периферии, состоящий из одного ряда клеток эпидермы. Сорванный кусочек положить на предметное стекло в каплю воды наружной стороной вверх и накрыть покровным стеклом. При малом увеличении рассмотреть вытянутые клетки в виде шестиугольников, бесцветные или окрашенные в бледно-фиолетовый цвет благодаря присутствию в вакуолях пигмента антоциана.
Задание 3. Научиться изготовлять разные виды срезов (поперечный, продольный радиальный, продольный тангентальный) из стебля подсолнечника (Helianthus annuus) и делать из них микропрепараты. Рассмотреть их под микроскопом.
Последовательность работы. Свежесрезанные или фиксированные междоузлия стебля (длиной 2 - 3 см , толщиной 7- 8 мм ) разрезать вдоль на 2 части. Невооруженным глазом или с помощью лупы на поперечном сечении стебля можно выделить две зоны: наружную - неоднородную, состоящую преимущественно из плотно сомкнутых клеток, и внутреннюю - рыхлую, построенную однородно.
Поперечные срезы. С выровненной поверхности одной из половинок сделать лезвием несколько поперечных срезов. Эти срезы должны захватить как периферическую часть, так и часть рыхлой сердцевины. С помощью препаровальной иглы или кисточки срез поместить в центр предметного стекла, окрасить его раствором сернокислого анилина, накрыть покровным стеклом и рассмотреть под микроскопом.
Продольные срезы. Для изготовления продольного радиального среза разрезать вдоль кусочек стебля подсолнечника так, чтобы разрез прошел через середину одного из крупных пучков, и с полученного радиального разреза сделать лезвием несколько тонких срезов. Срез поместить на предметное стекло, окрасить сернокислым анилином, накрыть покровным стеклом и рассмотреть под микроскопом.
Для изготовления продольного тангентального среза разрезать кусочек стебля подсолнечника перпендикулярно радиусу стебля, так чтобы он проходил под прямым углом к сердцевинным лучам. Произвести его окрашивание сернокислым анилином.
Одревесневшие оболочки клеток окрасятся в лимонно-желтый цвет.
Задание 4. Рассмотреть несколько постоянных микропрепаратов из комплекта "Анатомия растений". Сравнить временные и постоянные микропрепараты стебля подсолнечника.
Контрольные вопросы
1.Чем отличается временный микропрепарат от постоянного?
2. Как правильно изготовить временный микропрепарат?
3. Какой препарат называется тотальным?
4. Назвать виды срезов.